Comportamiento bacteria Pseudomonas stutzeri en la degradación de nanoplásticos

 Resúmen

El siguiente proyecto es el estudio del comportamiento de la bacteria ambiental Pseudomonas stutzeri DSM5190 en la degradación de nanopolímeros sintéticos de baja densidad, con la finalidad de generar un biocatalizador. Para este propósito, la actividad biodegradadora de la bacteria P. stutzeri se evaluó mediante ensayos de biodegradación utilizando la técnica instrumental FTIR del índice de carbonilo. 

Según literatura, las bacterias del género Pseudomonas poseen características únicas para descomponer plásticos PET, PVC, PEBD y PLA, existiendo registros actuales de estudios y descubrimientos relacionados a la capacidad de degradación de plástico por parte de enzimas bacterianas, las cuales hidrolizan enlaces éster en lípidos y en otros poliésteres. 

Algunos otros usos de la especie bacteriana escogida, es la valorización de residuos generados por la minería del cobre y la capacidad de sintetizar hidrocarburos. Esto nos señala que, la formulación de un agente biodegradante de plástico basado en P. stutzeri puede contribuir a la descontaminación del plástico, mediante una estrategia natural, amigable, poco invasiva y lo más importante, sustentable. La pérdida de masa para el tratamiento BD10M alcanzó un promedio de 4.4%, mientras que su control obtuvo un 3.3%, lo que señalaría, en principio, un efecto de mayor disminución de masa de plástico a consecuencia de la incubación de la bacteria (alrededor del 1.1%). A pesar de las diferencias, estas son cercanas; se espera que, en tiempos más prolongados, las diferencias entre tratamientos y controles pudieran incrementarse. 

Si bien las perspectivas de desarrollo de esta propuesta son alentadoras, el alcance es de estudio inicial. Dependiendo de los resultados a mayor cantidad de días para escalar su validación, y que en el futuro pueda ser una actividad complementaria a los actuales esfuerzos por mitigar los efectos nocivos.

Introducción

¿La contaminación por polímeros sintéticos en nuestros ecosistemas podrá mitigarse a través de la biorremediación por la bacteria Pseudomonas stutzeri?

      Hoy la era del plástico nos entrega su peor cara en la sobreutilización de estos, teniendo más de ocho tipos de plásticos circulando en nuestra vida cotidiana, provocando una producción enorme de estos. Para el 2030 existirán más plásticos que peces en el mar. ¿Entonces que esperamos para actuar? nuestro desafío como humanidad poder acortar el tiempo de degradación de los plásticos, ya que nuestros ecosistemas se ven afectados, por la descarga de grandes cantidades de plásticos no reciclados que provocan daños irreparables a nuestra flora y fauna pudiendo afectar incluso la salud de las personas. Un estudio realizado por la Agencia de Investigación Científica Gubernamental Australiana (CSIRO) señala que en el fondo de los océanos hay entre 8 y 14 millones de toneladas de microplásticos. Las tasas de producción de plástico se están intensificando y el volumen de desechos que los humanos liberan a los ecosistemas está creciendo a un ritmo exponencial. La basura impacta la vida silvestre directamente a través del enredo y la ingestión e, indirectamente, a través de reacciones químicas indeseadas. Incluso la pasta de dientes y los productos para el cuidado personal pueden contener micro perlas de plástico, los que sin tratamiento pueden ser consumidos por una amplia variedad de especies.  La bacteria ambiental Pseudomonas stutzeri, Se recolectará y se someterá a prueba en distintas masas de plásticos en distintos periodos de tiempo, para pruebas de biodegradación a través de la metodología instrumental FTIR la cuál determina el porcentaje de índice de carbonilo. En estudios comparados, el género Pseudomonas no solo degradó polietileno de baja densidad a causa de su actividad enzimática, sino también por su capacidad de generar biopelículas sobre el plástico gracias a su pared celular particularmente hidrofóbica (Tribedi y Sil, 2013). En el presente proyecto, probaremos la actividad biodegradadora de la bacteria Pseudomonas stutzeri DSM5190. El uso de este microorganismo por parte de aplicaciones relacionadas, tales como para sintetizar hidrocarburos y para la biorremediación de efluentes mineros en la industria del cobre, nos hace pensar que puede ayudar a la mitigación de contaminación por plásticos dada su morfología y fisiología (Lalucat, 2006).

Hipótesis

La bacteria ambiental de colección Pseudomonas stutzeri DSM5190 puede emplearse como un acelerador de la biodegradación de microplásticos de PEBD.

Objetivo General

Generar un biocatalizador en base a la bacteria Pseudomonas stutzeri DSM5190 para acelerar la biodegradación de microplásticos de baja densidad.

Objetivo Específico

eterminar la capacidad biorremediadora de la bacteria Pseudomonas stuzeri DSM 5190, para la degradación de otros nanoplásticos. Crear un filamento biodegradable para impresoras 3D con parte de la biomasa obtenido como subproducto después de la biorremediación.

Metodología

Lavado plástico (protocolo para piezas grandes de plástico) 

1. Recortar láminas de plástico colectado en cuadros de tamaño regular (se probarán dimensiones de 2*2, 3*3 y 4*4 cm). 

2. Transferir cuadros a un vaso con solución de lavado (7 ml de lavaloza + 10 ml de hipoclorito de sodio y 983 ml de agua destilada) y agitar por 30 min. 

3. Sacar cuadros y colocarlos en otro vaso con solución de etanol 70%. Mantener por 30 min. 

4. Cada cuadro es retirado y colocado en placa Petri estéril en estufa a 45-50°C. 

5. Pesar los cuadros secos. 

Cultivo 

1. Se prepara medio nutritivo NB (Peptona 5 g/L y Extracto de carne 3 g/L). 

2. Autoclavar a 121°C por 30 min. 

3. Inocular Pseudomonas stutzeri en matraces con 250 mL medio de cultivo. 

4. Incubar ON bajo agitación constante y a 37°C.

 

Biodegradación (protocolo para piezas grandes de plástico) 

1. Tres cuadros estériles (réplicas) son colocados en matraces Erlenmeyer con 50 ml de medio de cultivo estéril. 

2. Agregar 1 ml de cultivo bacteriano ON e incubar a 37°C bajo agitación contante durante el periodo de la prueba (se controlará la variable tiempo por períodos de 10, 20 y 30 d). En el caso del control (-), agregar agua destilada estéril. 

3. Al terminar, los cuadros son recuperados y lavados en etanol 70%. Luego secar en estufa a 45°C por 24 h. 

Análisis de biodegradación

 

1. Pesar los cuadros secos tras la biodegradación. Determinar la pérdida de masa (%M) de acuerdo con:

                         

2. Visualizar en lupa y microscopio óptico cada uno de los cuadros. Registrar observaciones de cambio físico. 

3. Identificar cambios en las composiciones superficiales del plástico mediante FTIR. Medir absorbancia en el rango de numero de onda 500-4000 cm-1 a una resolución de 1 cm-1. Determinar el índice carbonilo (IC) como indicador del grado de biodegradación de acuerdo con: 

Tabla de experimentos 

Evaluación del tiempo de exposición (tamaño 4*4 cm) 

 

Respuestas esperadas (ejemplo de análisis):

 

Otras variables que podrían estudiarse en el futuro: temperatura, tipo de plástico, concentración de biomasa. 

Lavado plástico (protocolo para piezas pequeñas de plástico) 

1. Lavar plástico con solución de lavado (7 ml de lavaloza + 10 ml de hipoclorito de sodio y 983 ml de agua destilada) y agitar por 30 min. 

2. Escurrir solución y agregar solución de etanol 70%. Mantener por 30 min. 

3. Retirar plástico y colocar en placa Petri para secado en estufa a 45-50oC. 

4. Pesar plástico de acuerdo con dosificación de tratamiento. 

Cultivo 

1. Se prepara medio nutritivo NB (Peptona 5 g/L y Extracto de carne 3 g/L). 

2. Autoclavar a 121°C por 30 min. 

3. Inocular Pseudomonas stutzeri en matraces con 250 mL medio de cultivo. 

4. Incubar ON bajo agitación constante y a 37º C. 

Biodegradación (protocolo para piezas pequeñas de plástico)

 

1. Plástico es pesado (0.5, 1 y 2 g) y colocado en matraces Erlenmeyer con 50 ml de medio de cultivo estéril. 

2. Agregar 1 ml de cultivo bacteriano ON e incubar a 37°C bajo agitación contante durante el período de la prueba (se probarán períodos de 10, 20 y 30 d). En el caso del control (-), agregar agua destilada estéril. 

3. Al terminar, el plástico es recuperado y lavado en etanol 70%. Luego secar en estufa a 45°C por 24 h. 

Análisis de biodegradación 

1. Pesar el plástico seco tras la biodegradación. Determinar la pérdida de masa (%M) de acuerdo:

                                 

                      

2. Visualizar en lupa y microscopio óptico cada uno de los cuadros. Registrar observaciones de cambio físico. 

3. Identificar cambios en las composiciones superficiales del plástico mediante FTIR. Medir absorbancia en el rango de numero de onda 500-4000 cm-1 a una resolución de 1 cm-1. Determinar el índice carbonilo (IC) como indicador del grado de biodegradación de acuerdo con: 

                          

                          

Tabla de experimentos 

Evaluación del tiempo de exposición. Pruebas corridas con dosificación de 1 g de plástico. 

 

Respuestas esperadas (ejemplo de análisis) 

Resultados

La pérdida de masa para el tratamiento BD10M alcanzó un promedio de 4.4%, mientras que su control obtuvo un 3.3%, lo que señalaría, en principio, un efecto de mayor disminución de masa de plástico a consecuencia de la incubación de la bacteria (alrededor del 1.1%) (Tabla 1). A pesar de las diferencias, estas son cercanas; se espera que, en tiempos más prolongados, las diferencias entre tratamientos y controles pudieran incrementarse. 

La pérdida de masa del plástico control puede deberse a la naturaleza menos densa de su estructura, la que, en condiciones de agitación constante bajo una solución acuosa (medio de cultivo) y temperatura de 37ºC, puede en parte degradarse. Aún nos encontramos esperando los resultados a 20 y 30 días donde esperamos el incremento de biodegradación aumente.

Tabla 1. Resultados de masa de nanoplástico tras los experimentos de biodegradación de 1 g. Las masas son secas. 

Análisis y discusión

Los resultados del experimento nos demuestran que efectivamente existe biodegradación del plástico por parte de la bacteria Pseudomonas stutzeri mediante la metodología utilizada y bajo los parámetros controlados (37 º C y agitación constante durante 10 días). En ensayos de biodegradación se observa una pérdida de la biomasa en los tratamientos en comparación al control, cuya diferencia de perdida de biomasa es de 1,1 % (tratamiento BP10 M), lo cual comprueba la factibilidad de la aplicación de la metodología propuesta.

Es importante tener en cuenta que la biodegradación depende de varios factores, tanto físicos y químicos además del tiempo de experimentación, existiendo en la literatura diversos registros de las condiciones utilizadas para el desarrollo de algunas especies de Pseudomonas. (Butron,2020). Se reporta a condiciones de 25 a 37 ºC. Con un pH de 5 a 7 a 30 días, una biodegradación de 27,3 %.

Por otra parte (Martinez, 2016), reporta una biodegradación del 10,3 %, para Pseudomonas  aereginosa , en condiciones de 25ºC pH 7 en 35 días. Por o cuál se deduce que nuestros resultados pueden ser optimizados mediante el control de los diferentes parámetros físico-químicos de los ensayos de biodegradación. Entre los factores más importantes a controlar tenemos, la forma, peso, peso molecular densidad del plástico, cantidad de regiones amorfas del polímero, la complejidad estructural del plástico y su composición molecular (Shabbin, 2020), el pH del medio (Romero, et al, 2008; Acuña, 2017) y temperatura (Alania y Pérez, 2017; Yang et al, 2020).

Conclusiones

La vida en la tierra de un plástico son aproximadamente 100 años, poder minimizar ese tiempo 20-30 años es algo que a través de este trabajo de investigación podemos visualizar ya que la bacteria ambiental Pseudomonas stutzeri  DSM5190  demostró en 10 días de diseño experimental poder biodegradar un 1,1, %  del índice de carbonilo, bajo la técnica instrumental FTIR. Como seres humanos, hemos comenzado a tomar conciencia de la importancia de la separación de residuos, no obstante, sabemos que falta mucho más. Lograr estudiar a fondo los microorganismos del género Pseudomonas, contribuye como una solución, para la biodegradación de los nanoplásticos que tanto contaminan. Poder llevar este proyecto a macroescala, en condiciones óptimas nos permitir acelerar el proceso de degradación de plásticos, especialmente microplásticos de baja densidad distribuidos en toda la corteza terrestre y marítima.

Se tiene muy poca información del comportamiento de estos microorganismos degradadores, se debe seguir experimentando, Ya que los microorganismos, como la bacteria P. stutzeri, son cruciales en la disminución del Cambio Climático. Las proyecciones para este proyecto son muy amplias; Crear piscinas biorremediadoras, determinar la cinética de reacción del género Pseudomonas y con la biomasa obtenido como producto se puede crear filamento para impresoras 3D que sean mucho más amigable con el medio ambiente.

Es necesario generar hábitos en toda la sociedad, promover la utilización de productos biodegradables por sobre polímeros sintéticos y fomentar tanto en niños como en adultos las 3Rs (Reducir, Reutilizar y Reciclar). Aplicar estos avances en la ciencia y tecnología podrán asegurar generaciones más sustentables.

Referencias Bibliográficas

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